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  王东辉

  北京大学

1、切片实验技术

石蜡切片，组织学常规制片中最为广泛应用的方法，不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中，它是最基本、最经典的实验技术。

石蜡切片实验包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与贴片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。

第一周：材料的取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋过程

第二周：切片机使用、包埋材料的修块，切片与贴片、烘片

第三周：石蜡切片的脱蜡、复水、染色

第四周：石蜡切片的封片、显微观察

2、激素或者蛋白免疫组化（IHC）或者免疫荧光（Immunofluorescence）定位技术

免疫组化（IHC）或者免疫荧光（Immunofluorescence）利用抗体检测组织切片中蛋白质和其他抗原的定位，抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，IHC 可以提供完整组织中蛋白定位的宝贵信息，是一种广泛应用的技术。多重免疫组织化学/免疫荧光（Multiplex Immunohistochemistry/Immunofluorescence，mIHC/IF）已成为一种非常有前景的技术。mIHC/IF提供高通量的多重染色和标准化的定量分析，并且重复性好、时间成本效益高。这项技术在植物发育学、转化医学等研究中都具有强大的应用潜力。

免疫组化包括石蜡切片的所有步骤，在石蜡切片的基础上进行免疫学反应，后续步骤包括切片脱蜡复水、封闭反应、一抗结合、二抗结合、显色反应等步骤。

第五周：石蜡切片制作

第六周：石蜡切片的脱蜡复水，抗体或者激素的免疫反应

第七周：石蜡切片的二抗结合，洗涤、显色反应

第八周：显色反应后的洗涤及显微观察

3、原位杂交实验技术

原位杂交（Insitu hybridization ，ISH）mRNA检测，顾名思义，是一种定位和检测特定的mRNA序列在组织的方法，是发育生物学研究的一种基本的实验技术。原位杂交的价值和贡献在于通过标记的探针和靶基因反应的专一性（核酸杂交配对），揭示了组织内目标核酸精确定位，可以展现出在细胞水平甚至亚细胞水平下基因的时空表达情况。最近数十年在最初的放射性原位杂交技术的基础上发展出各种非放射性标记的原位杂交技术被广泛的应用于各个物种的基因表达检测，迄今为止，ISH仍然是基因表达分析的理想选择。

原位杂交包括石蜡切片的所有步骤，在石蜡切片的基础上进行原位杂交反应，后续步骤包括探针制备、切片脱蜡复水、探针结合、二抗结合、显色反应等步骤。

第九周：探针的模板准备，探针标记、探针检测

第十周：石蜡切片及其脱蜡复水、切片封闭、探针杂交反应

第十一周：二抗结合，洗涤、显色反应实验

第十二周：显色反应后的洗涤及显微观察

4、徒手切片的蛋白定位实验技术

徒手切片操作简单，与石蜡切片方法相比不需要进行脱水、浸蜡、包埋等过程，从而大大缩短实验操作流程，减少耗时，且仅在透明和染色过程中需用试剂处理材料，从而降低实验成本。另外，徒手切片还不需要切片机等贵重仪器，作为对于解剖学突变体的预筛选过程，可以很大程度上减少工作量，提高筛选速率，降低研究成本。还可以作为对需要做石蜡切片观察的实验材料进行初选，及对不需要进行精细观察组织结构的实验研究提供简便方法

第十三周：徒手切片的材料固定及溶液配制

第十四周：徒手切片及前处理

第十五周：切片的脱水、透明，免疫反应

第十六周：切片的二抗反应及显色观察

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